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ELISA實驗標本如何處理和收集?

2018-09-04 瀏覽次數(shù):3645

能夠應用ELISA 實驗的樣本種類很多,有血清,血漿,細胞裂解液,細胞培養(yǎng)上清,尿液,肺泡灌洗液,腦脊液,各種組織勻漿等,每種樣本采集和處理的方式都不相同。市場部通過文獻、試劑盒說明書和網友的經驗,整理出以下方法僅供參考。

 

一 血清

1 采血后室溫靜置20min或更長時間至血清析出。

2 將采集的血液用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存?zhèn)溆?,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為標記的 ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。此外還應避免細菌污染,因為菌體中可能含有含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。血清標本宜在新鮮時檢測。如在冰箱中保存過久,在間接法ELISA中可使本底加深。

 

二 血漿

1 取血后加入抗凝劑(EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉等),混合10-20分鐘后,30分鐘內于冰上分離血漿以減少血小板的污染(也可以直接用抗凝管采集)。

2 將采集血液用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存?zhèn)溆?,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

注意事項:制備血漿標本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不*的標本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。請注意指標說明書上對于抗凝血劑是否有特殊要求,建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。

 

三 尿液

1 采集尿液樣本500ul,加入無菌試管中。

2 用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的樣本小心收集上清,棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存?zhèn)溆?,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

 

四 細胞培養(yǎng)上清

1 用無菌試管收集細胞培養(yǎng)上清液。

2 用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存?zhèn)溆?,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

 

保存時間

一般ELISA檢測樣本在2-8℃下,可放置保存24-48小時;-20℃下,可放置保存1個月;-70℃下,可放置保存6個月。

 

五  組織勻漿

1 采集組織,在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,剔除附屬的結締組織,稱取組織塊。

2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質或生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天熱時操作要在冰水浴中進行,將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。

3 勻漿的方式有多種:

a) 手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉動研磨數(shù)十次(68分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。

b) 機器勻漿:用組織搗碎機1000015000r/min上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內切式組織勻漿機制備(勻漿時間10/次,間隙30秒,連續(xù)35次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

c) 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發(fā)生儀,用40安培,5/次,間隙10秒反復35次。

4 將制備好的10%勻漿用離心機4℃,3000rpm離心15min,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。

5 取上清并分裝保存?zhèn)溆?,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

 

六  細胞裂解液

1 取細胞培養(yǎng)板或細胞懸液,用PBSPH7.2-7.4)洗滌細胞培養(yǎng)板1-2次。

2 通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑(裂解液),使細胞破壞并放出細胞內成份。

3 用離心機4℃,2000rpm離心20min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。

 

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