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如何能把ELISA實(shí)驗(yàn)做好?操作過程中的注意事項(xiàng)?。?/h1>

2020-06-30 瀏覽次數(shù):2513

1. 試劑盒使用前室溫平衡20-30分鐘

溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素,為使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng),實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有的試劑平衡至室溫,包括檢測樣本,避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。若無該過程,可能導(dǎo)致一些弱陽性樣本出現(xiàn)假陰性。

 

2. 規(guī)范加樣:不規(guī)范的移液操作可能帶來0.1%到5%的移液誤差,甚至更高!

a. 移液器定期校準(zhǔn):選擇密封性好質(zhì)量可靠的吸頭,吸量不準(zhǔn)確,直接影響檢測結(jié)果;

b. 加樣前,溶液充分混勻,垂直懸空加入液體,避免加在孔壁上,不可產(chǎn)生氣泡;

c. 加樣時(shí)避免液體濺出,如有樣本濺出,應(yīng)用吸水紙輕輕拭干,并做相應(yīng)記錄;

d. 如果加樣槍漏氣以至于加樣的量不夠,不能用槍吸出再加,做相應(yīng)記錄實(shí)驗(yàn);

e. 每次加樣順序一致,尤其底物、終止液順序一致,保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。


3. 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解與稀釋,嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。

a. 粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心,讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。

b. 根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水(或說明書溶液),加水后輕柔渦旋震蕩,室溫靜置溶解10-30分鐘,讓粉末*溶解。

注意:加水(或說明書溶液)后暫不用移液槍吹吸,避免蛋白未溶解,槍頭帶出部分蛋白,待*溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。

 

4. 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做復(fù)孔

復(fù)孔的目的在于:可以計(jì)算檢測結(jié)果平均值,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確;通過復(fù)孔結(jié)果對(duì)比,評(píng)估試劑盒的精密度及實(shí)驗(yàn)中是否存在誤操作;


5. 震蕩操作

a. 孵育過程震蕩,可以加快、加強(qiáng)抗原抗體之間的相互碰撞接觸,使得反應(yīng)更加*,OD值通常比未震蕩孵育的結(jié)果要高;

b. 洗滌過程中震蕩,可以使洗板更干凈,很大程度上降低背景值,同時(shí)提高試劑盒檢測的靈敏度。


6. 洗滌操作

a. 手工洗板,拍板時(shí)要垂直,避免交叉污染,用力不能過猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離;

b. 機(jī)器洗板應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通,若被雜物堵塞可用注射器針頭挑出。

c. 扣干后的酶標(biāo)板應(yīng)立即加液,不能干板太久。

 

7. 顯色判斷

說明書中提供的顯色時(shí)間僅為經(jīng)驗(yàn),具體時(shí)間需隨時(shí)注意觀察。通常濃度的標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深,S1、S2、S3有明顯梯度,S5有淡藍(lán)色,或者標(biāo)準(zhǔn)品S1孔在630 nm的OD值在0.5-0.7、S5孔的OD值達(dá)到0.05-0.08,可以終止反應(yīng)。

 

8. 檢測

a. 酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15分鐘,使結(jié)果更穩(wěn)定;

b. 采用雙波長測定吸光值,排除單波長檢測時(shí)的測定干擾(樣本的干擾、干擾色等)。一般采用大波長為參考波長,在參考波長630 nm(570 nm)下,檢測物的吸光值小,檢測波長450 nm和參考波長630 nm(570 nm)的吸光值之差可以消除非特異性吸收,雙波長測定,可以大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差,以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

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